Indagini microbiologiche

ASPETTI GENERALI

La finalità delle indagini microbiologiche è quella di ricercare, in modo rapido e accurato, gli agenti responsabili di processi infettivi a eziologia batterica o fungina, con il duplice scopo di identificarli e di determinare la sensibilità agli antibiotici. Per garantire la significatività dei risultati è necessario che i campioni da esaminare siano prelevati e inviati in Laboratorio seguendo scrupolosamente i suggerimenti di carattere generale di seguito indicati.

• Raccogliere i campioni biologici possibilmente prima dell'inizio della terapia chemioantibiotica.
• Eseguire il prelievo dalla sede anatomica del processo patologico.
• Evitare ogni contaminazione esogena ed endogena del campione.
• Utilizzare contenitori appropriati alle indagini:
• per gli esami colturali il tampone con terreno di trasporto in mezzo liquido Amies TRANSWAB (codice Farmacia 435608)
• per i test in biologia molecolare i tamponi Floq Swabs con tappo rosso

                   (codice Farmacia 427366) o con tappo arancione (codice Farmacia 427364),

• per l’urinocoltura provette con acido borico (codice Farmacia 435612)
• per il sangue o altri liquidi potenzialmente sterili i flaconi Versatrek (codice Farmacia 435825 /435826).
•  Eseguire tempestivamente il trasporto dei campioni al Laboratorio di Microbiologia. Se il prelievo è stato eseguito con i sopraindicati tamponi/contenitori, è possibile l’invio ritardato di 12-24 ore, conservando il campione a temperatura di 2-8°C, mentre i flaconi Versatrek devono essere inviati h 24 al Laboratorio Urgenze.
• Inviare on line la richiesta solo quando è recapitato in Laboratorio il campione biologico etichettato.
• In caso di colture positive si procede di routine all’identificazione microbica con il sistema MALDI TOF (matrix assisted laser desorption ionization tof), che analizza la composizione proteica della cellula microbica, e all’antibiogramma secondo le linee guida EUCAST.

N.B. I tempi di refertazione presuntivi sono indicati in tabella n.1

Tipo di esame	Tempi di refertazione
Colturale negativo	24-48 ore
Colturale positivo	48-72 ore
Biologia molecolare	1-5 giorni

 Tabella n.1

URINE
URINOCOLTURA
In caso d’infezioni delle vie urinarie sono ricercati i seguenti microrganismi: Enterobatteri, Pseudomonas, Stafilococchi, Streptococchi e Lieviti. La carica significativa è posta al di sopra di 100.000 UFC / ml, tranne che per urine raccolte con il catetere. L'informazione circa l'eventuale terapia antibiotica in corso o sospesa da meno di tre giorni può essere utile al fine di interpretare cariche inferiori.
Qualora l'esame colturale presenti una crescita di due o più stipiti batterici diversi l'urinocoltura sarà refertata come non idonea per contaminazione. In caso di sintomatologia persistente e ripetute urinocolture negative, mettersi in contatto con il Llaboratorio per eventuali ricerche di germi non usuali.
Materiali necessari
Contenitore sterile a bocca larga o, in alternativa, quando non sia possibile inviare il campione entro due ore, provetta con batteriostatico.
Procedure di prelievo
Adulti

• Raccogliere l'urina del primo mattino o che è stata in vescica almeno due ore
• detergere i genitali esterni con soluzione saponosa
• risciacquare ripetutamente
• espellere la prima parte dell'urina (primo mitto) e raccogliere in contenitore sterile, la seconda parte dell'urina (mitto intermedio), facendo attenzione a non toccare i bordi dello stesso
• chiudere il coperchio del contenitore e svuotare completamente la vescica.

Cateterizzati

• Lavarsi le mani con antisettico
• raccogliere l’urina direttamente dal raccordo del catetere a circuito chiuso.

     N.B. non raccogliere l'urina dalla sacca o sconnettendo il catetere.
Lattanti e bambini
Utilizzare, quando sia possibile, il mitto spontaneo. L'uso dei sacchetti sterili da applicare sulla cute del bambino è gravato da un'alta percentuale di contaminazione. Qualora non ci fossero alternative, il sacchetto deve essere rimosso e sostituito ogni trenta minuti e, appena l'urina sia stata emessa, tolto e accuratamente richiuso.
Conservazione e invio
La conservazione a temperatura ambiente per più di due ore rende il risultato non attendibile in caso di positività.
Se l'urina non può essere trasportata al laboratorio a temperatura ambiente entro le due ore, si consiglia trasferirla subito  nella provetta con batteriostatico, che può essere conservata per 24/36 h a temperatura ambiente.
Ricerca  Schistosoma haematobium
I campioni urinari sono analizzati, in seguito alla specifica richiesta, per la ricerca di uova di Schistosoma haematobium, in soggetti sintomatici (febbricola e/o ematuria e/o proteinuria) provenienti da zone in cui la schistosomiasi è endemica.

Materiali necessari

Contenitore sterile a bocca larga, con tappo a vite.
Procedure di prelievo

• Raccogliere l’urina preferibilmente tra le ore 10 e le 14 (in queste ore l’emissione delle uova è più alta)
• urinare completamente
• eseguire venti piegamenti sulle ginocchia e, quindi, bere 2-3 bicchieri d’acqua
• raccogliere tutta l’urina nel contenitore fino a svuotamento della vescica.

Conservazione e invio
È possibile conservare il campione nel contenitore sterile a 2-8 °C fino a 48 ore.
Ricerca antigene urinario Legionella pneumophila
Per la diagnosi di legionellosi è possibile eseguire il test immunocromatografico rapido per la ricerca dell’antigene urinario del sierogruppo 1 della Legionella pneumophila.
N.B.Un risultato positivo può essere causato da infezione in atto o precedente e non è definitivo senza evidenza clinica.

Materiali necessari

Contenitore sterile a bocca larga, con tappo a vite.
Procedure di prelievo
Raccogliere urina di una qualsiasi minzione giornaliera.
Conservazione e invio
Inviare l’urina subito o conservarla a +2°-8°C, per 24 ore.

 

FECI
          Coprocoltura
Serve per la diagnosi di gastroenterite e il protocollo standard prevede la ricerca della Salmonella, Shigella e Campylobacter.         

Materiali necessari

Contenitore sterile con paletta o con terreno di trasporto Transfec (codice Farmacia 410278) o tampone sterile con terreno di trasporto Cary-Blair (codice Farmacia 435607)
Procedure di prelievo
FECI: evacuare in un recipiente pulito e , con l'apposita paletta presente nel contenitore , prelevare una piccola quantità (0,5-2 g/5-10 ml.)
TAMPONE: pulire la zona anale con acqua calda, senza usare disinfettanti, inserire il tampone nel canale rettale per circa 2 cm e lasciare inserito il tampone per 10 secondi, ruotandolo contro le pareti mucose, fino a che non sia sporco di feci.
Conservazione e invio
Le feci vanno inviate nel più breve tempo possibile in laboratorio; in caso d’impossibilità utilizzare il contenitore con terreno di trasporto o nei bambini, eseguire tampone rettale, da conservare a temperatura di 2-8° C. per 12-24 ore.
RICERCA Rotavirus/Adenovirus, Helycobacter pylori
La ricerca di questi microrganismi è eseguita su specifica richiesta.

Materiali necessari

Contenitore per feci con paletta (non idonei campioni raccolti con il tampone).

Procedure di prelievo
Evacuare in un recipiente pulito e , con l'apposita paletta presente nel contenitore ,  prelevare una piccola quantità (0,5-2 g/5-10 ml.)
Conservazione e invio
I campioni devono essere inviati in laboratorio il prima possibile o conservati a temperatura di 2 -8° C per 12-24 ore.

Esame parassitologico

Serve per diagnosticare l’origine parassitaria d’infezione/infestazione o la causa di diarrea negli immunodepressi. Essendo le parassitosi più frequenti nei paesi tropicali e subtropicali, è fondamentale fornire informazioni anamnestiche dei pazienti. (provenienza geografica, soggiorno all’estero per turismo o lavoro)
Materiale necessario

Flacone con fissativo fornito dal Laboratorio.

Procedure di prelievo

• Non assumere lassativi prima della raccolta dei campioni
• raccogliere tre campioni per tre giorni alterni
• evitare la contaminazione con le urine
• non raccogliere il campione direttamente dalla tazza del WC
• raccogliere le feci in un contenitore pulito e asciutto oppure inserire un foglio di plastica sotto il sedile del water
• aprire il contenitore fornito, raccogliere conla palettina le  feci (non superare la linea rossa)
• chiudere accuratamente e agitare energicamente il flacone per omogeneizzarne il contenuto.

Tempi di risposta
1 giorno

Ricerca Giardia, Cryptosporidium

La ricerca di questi parassiti è eseguita su specifica richiesta con test immunocromatografico, osservando le stesse modalità di prelievo, conservazione e invio dell’esame parassitologico.

Scotch test (Ricerca Ossiuri)

Enterobius vermicularis è agente eziologico di una delle parassitosi più frequenti: ciò è dovuto alla rapida maturazione delle uova e alla loro facile dispersione nell’ambiente.
L’accertamento diagnostico di elezione è lo SCOTCH TEST.
Materiali necessari

• Scotch trasparente
• vetrino portoggetti (fornito dal laboratorio.)
• abbassalingua.

 Modalità di prelievo

• Al mattino prima di lavarsi o di evacuare, applicare del nastro adesivo trasparente (scotch) sull'estremità di un abbassalingua con la parte adesiva all'esterno
• premere la parte adesiva contro diverse aree della zona perianale
• disporlo su un vetrino e inviarlo in microbiologia.

 

Conservazione e invio
È possibile conservare il vetrino a temperatura ambiente fino a 72 ore.

Ricerca Clostridium difficile

Non tutti i ceppi di C. difficile producono tossine e, di conseguenza, generano malattia:solo i ceppi tossigenici producono tossine proteiche di grandi dimensioni (A e B), che rappresentano i principali fattori di virulenza.

La produzione delle due tossine A (enterotossina) e B (citotossina) causa il caratteristico danneggiamento della mucosa, che si manifesta con lesioni a placca e successiva formazione di pseudomembrane.

Pertanto il protocollo diagnostico prevede la ricerca del GDH, enzima presente in tutti i ceppi di Clostridium difficile (tossigeno e non), con alto valore predittivo negativo; in caso di positività è eseguita la ricerca, in biologia molecolare, dei ceppi tossigeni.

Materiali necessari

Contenitore per feci con paletta

Procedure di prelievo

Raccogliere solo feci diarroiche (tipo 5-7 della scala di Bristol) e trasferire nel flacone una piccola quantità di feci.

Conservazione e invio
In caso d’invio ritardato conservare il campione a temperatura di 2-8°C per 12-24 ore.
Tempi di risposta
3 ore
Multiplex P.C.R. diarrea
In aggiunta alla coprocoltura standard è possibile effettuare una multiplex P.C.R. che identifica contemporaneamente i seguenti patogeni:

• Adenovirus, Astrovirus, Norovirus, Rotavirus
• Salmonella spp.,Shigella spp. (S. flexneri,S.boydii,S.sonnei e S.dysenteriae)
• Vibrio spp. (V.cholerae,V.parahamolyticus e V. vulnificus)
• Campylobacter spp. (C.jejuni e C.coli)
• C.perfrigens, Yersinia enterocolitica, Aeromonas spp.
•  E.coli O157:H7.

Materiale necessario
Contenitore per feci con paletta o tamponi Floq Swabs (tappo rosso).
Procedure di prelievo
Raccogliere un campione di feci o nei bambini eseguire un tampone rettale.
Conservazione e invio
I campioni devono essere inviati in laboratorio il prima possibile o conservati a temperatura di 2 -8° C al massimo per 12-24 ore.
N.B.
Il test di screening sulle feci per valutare la colonizzazione da Klebsiella pneumoniae resistente ai carbapenemi (KPC) va eseguito su tampone rettale e richiesto nel link delle colture di sorveglianza.

 

SANGUE
Emocolture
Il protocollo standard è indirizzato alla ricerca di batteri aerobi, anaerobi e lieviti
Modalità di prelievo
Il prelievo si esegue da vena periferica, ma in caso di pazienti portatori di catetere venoso si esegue contemporaneamente il prelievo sia da catetere sia da vena periferica.
E' consigliabile:

• eseguire l'emocoltura prima dell'inizio della terapia antibiotica o immediatamente prima della somministrazione
• procedere a più prelievi per aumentare la sensibilità dell'esame e per facilitare l'interpretazione dei risultati (il riscontro in campioni multipli di microrganismi opportunisti consente l'attribuzione agli stessi di un ruolo eziologico)
• prelevare una corretta quantità di sangue per rispettare un corretto rapporto brodo di coltura/sangue immesso nel flacone (solo nei neonati o bambini possibile inoculo  di quantità inferiori)
• quando possibile, eseguire i prelievi all'inizio del rialzo termico.

Materiali necessari

• Antisettico
• set di prelievo monouso per emocoltura
• flacone per emocoltura in aerobiosi (tappo blu)
• flacone per emocoltura in anaerobiosi (tappo rosso)
• etichette con codice a barre per ogni set di prelievo.

Procedure di prelievo

• Iindividuare il sito del prelievo
• lavare accuratamente le mani con acqua e sapone
• indossare guanti monouso
• disinfettare la cute con un impacco di clorexidina in soluzione alcolica per 30-60 secondi (l’azione del disinfettante è tempo-dipendente)
• disinfettare il gommino da perforare
• eseguire il prelievo senza toccare con le dita la zona; se necessario utilizzare guanti sterili
• prelevare il sangue inoculandolo nel flacone per aerobi (tappo blu) e, poi, nel flacone per anaerobi (tappo rosso), non superando la quantità massima consigliata
• subito dopo il prelievo agitare leggermente per inversione il flacone
• estrarre l'ago dalla vena ed eliminarlo nel contenitore rigido
• non coprire il gommino perforabile dei flaconi con garze e cerotti
• non coprire con etichette adesive il codice a barre dei flaconi
• cambiare etichette di barcode per altro set di prelievo .

Conservazione e invio
Inviare tempestivamente i flaconi al Laboratorio Microbiologia dalle h 8.00 alle h 14.00 dal lunedì al sabato; nei giorni e nelle ore di chiusura del Laboratorio di Microbiologia al Laboratorio Urgenze.
Tempi di refertazione
In caso di positività (mediamente 24-48 ore d’incubazione) il Laboratorio invierà on-line l’identificazione microbica effettuata direttamente dal flacone di emocoltura, che ha segnalato crescita microbica , e dopo 24 ore l’eventuale antibiogramma; in caso di negatività i tempi di coltura sono cinque giorni.
Multiplex Sepsi Real- time
Consente la rivelazione rapida in P.C.R. real – time di 27 patogeni,più frequentemente causa di sepsi. La metodica prevede: un primo step che riconosce i batteri GRAM-, GRAM+, funghi e alcuni geni di resistenza (mecA, vanA, vanB) e un secondo step che identifica i   patogeni
Materiale necessario
Provetta per emocromo
Procedure di prelievo
In caso di sospetto clinico di sepsi/shock settico,si consiglia eseguire il prelievo contemporaneamente all’emocoltura.
Conservazione e invio
Inviare tempestivamente i flaconi al Laboratorio Microbiologia dalle h 8.00 alle h 14.00 dal lunedì al sabato; nei giorni e nelle ore di chiusura del Laboratorio Microbiologia al Laboratorio Urgenze.
Tempi di refertazione
Il test si esegue ogni giorno, tranne i festivi, e i tempi tecnici teorici sono 5-6 ore; il Laboratorio invierà on-line l’identificazione microbica.

Ricerca parassiti ematici

Il sangue periferico costituisce il materiale di elezione per la diagnosi eziologica di parassiti ematici e, in particolare, di Plasmodium spp. ; l’indagine microbiologica si basa sulla lettura dello striscio di sangue dopo colorazione.
Il test trova indicazione in pazienti che abbiano soggiornato in zone endemiche e che presentino sintomatologia compatibile.

Materiali necessari

Provetta con EDTA per emocromo (tappo viola)
Procedure di prelievo
Il tempo del prelievo può essere critico, in relazione al ciclo biologico dei parassiti, e per la diagnosi di malaria il prelievo dovrebbe essere eseguito preferibilmente durante la puntata febbrile.
Conservazione e invio
Inviare tempestivamente il materiale al Laboratorio di Microbiologia; quando non possibile, conservare a temperatura ambiente fino a un massimo di 3 h. Durante le ore di chiusura del laboratorio, inviare il prelievo al Laboratorio Urgenze.
Ricerca Criyptococcus neoformans
Il Criptococco neoformans è agente eziologico di infezioni opportuniste in pazienti immunodepressi.

Materiali necessari

Provetta sierologica

Conservazione e invio
Inviare durante l’orario di apertura del Laboratorio di Microbiologia.

LIQUIDI BIOLOGICI
Le indagini microbiologiche di liquidi potenzialmente sterili sono indirizzate alla ricerca di batteri aerobi, anaerobi e lieviti. La possibilità di ricercare microrganismi anaerobi è subordinata alla raccolta del campione con siringa da cavità chiuse e inoculo immediato in flacone per anaerobi.
Altre ricerche(es. Mycobacterium spp. e miceti filamentosi) saranno effettuate solo su specifico sospetto clinico.
Le modalità di prelievo, conservazione e invio dei materiali da cavità sterili (liquido pleurico, liquido pericardio,liquido peritoneale/ascitico,liquido articolare /sinoviale,umor vitreo/umor acqueo,bile da prelievo intraoperatorio,pus da raccolta profonda) sono di seguito descritto.
Materiali necessari
Flacone Versatrek per aerobi e anaerobi.
Procedure di prelievo

• Prelevare con siringa sterile ed eliminare completamente eventuali bolle d'aria
• trasferire da 0,1 a 5 ml il materiale prima nel flacone per aerobi (tappo blu) e poi nel flacone per anaerobi (tappo rosso.)
• inoculare lentamente il sangue nel flacone, evitando di introdurre aria.

Conservazione e invio
Inviare tempestivamente al Laboratorio di Microbiologia o durante l’orario di chiusura del Laboratorio di Microbiologia al Laboratorio Urgenze.

LIQUOR CEFALORACHIDIANO
Le indagini microbiologiche su liquido cefalorachidiano sono eseguite per confermare il sospetto clinico di meningite o meningo-encefalite e identificare l'agente eziologico.  In contemporanea all’esame colturale può essere eseguito una multiplex P.C.R. per la ricerca di batteri (S. pneumoniae, H.influenzae tipo b, N.meningitidis, S. agalactiae, L.monocytogenes) e di virus (erpetici HSV1, HSV2, CMV,EBV,VZV,HHV6).  Inoltre, è possibile ricercare nei bambini Human Enterovirus, negli immunodepressi Toxoplasma gondii e Cryptococcus neoformans e, in caso di sospetto diagnostico, Mycobcterium tuberculosis c. e Poliomavirus umano (JCV).
Materiali necessari
Provetta sterile con tappo a vite.
N.B. per la ricerca dei Micobatteri la quantità deve essere > 2 ml
Procedure di prelievo
Il prelievo del liquor è manovra di competenza del medico specialista.
Conservazione e invio
Il campione deve essere recapitato al Laboratorio di Microbiologia nel più breve tempo possibile (al massimo 30 minuti).
Durante le ore di chiusura del Laboratorio di Microbiologia immettere parte del liquor cefalorachidiano(almeno 1 ml) in un flacone per emocolture per aerobi (tappo blu) e consegnarlo al Laboratorio Urgenze; conservare un'aliquota in provetta sterile a 2-8° C per le indagini di biologia molecolare.

CAmpioni alte VIE RESPIRATORIE

Essudato faringeo

Le indagini microbiologiche su essudato o tampone faringeo sono di norma indirizzate alla ricerca dello Streptococco beta emolitico di gruppo A (Streptococcus pyogenes), per diagnosi di faringotonsillite o ricerca di portatori. Tale ricerca, giustificata dalla responsabilità eziologica di S. pyogenes nel determinare la malattia reumatica, costituisce il protocollo standard per le indagini su questo materiale.
Ogni altra ricerca (N. meningitidis, S. aureus, C. diphtheriae) deve essere specificata e motivata.
Materiali necessari
Tampone con terreno di trasporto Amies (TransWab)
Procedure di prelievo
Si raccomanda di eseguire il tampone faringeo lontano dall'assunzione di cibo poiché la stimolazione della faringe potrebbe indurre il riflesso del vomito.

• Premere la lingua con un abbassalingua
• guidare il tampone fino alla parte posteriore della faringe avendo cura di non toccare la lingua, le arcate dentarie e le pareti laterali del cavo orale
• strisciare energicamente il tampone tra i pilastri tonsillari, premendo sulle cripte tonsillari.

Conservazione e invio
I campioni vanno inviati subito o possono essere conservati in terreno di trasporto a temperatura di 2- 8°C per 12-24 h.
Ricerca diretta Streptococcus pyogenes
Ove sia clinicamente necessaria una rapida diagnosi, è possibile l’identificazione dell’antigene dello Streptococcus di gruppo A, con test immunocromatografico, osservando le stesse modalità di prelievo, conservazione e invio dell’esame colturale.
Secreto nasale
I tamponi nasali non rappresentano una tipologia di campione idonea per identificare l’agente eziologico di sinusite e dovrebbero essere utilizzati solo per il rilevamento del portatore di Streptococco di gruppo A (S.pyogenes) o di Staphilococcus aureus meticillino resistente.
Per i pazienti oncologici o in soggetti compromessi per varie cause (diabete, trapianto) può essere appropriato lo screening per la ricerca di miceti (Candida spp., Mucorales).
Materiali necessari
Tamponi Floq Swabs con tappo arancione
Procedure di prelievo
Inserire il tampone nelle cavità nasale, fino a incontrare un ostacolo e ruotarlo per qualche secondo
Conservazione e invio
I campioni vanno inviati subito o possono essere conservati in terreno di trasporto a temperatura di 2- 8°C per 12-24 h.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CAMPIONI RESPIRATORI BASSE VIE
L’espettorato e il broncolavaggio / broncoaspirato rappresentano i materiali di elezione per la diagnosi delle infezioni delle basse vie respiratorie.  Il risultato dell’esame colturale è espresso in forma quantitativa perché la conoscenza della carica microbica consente di discriminare la flora responsabile d’infezione dalla flora contaminante; gli agenti eziologici di polmoniti sono generalmente presenti in alte concentrazioni nelle secrezioni respiratorie, quando il materiale è raccolto correttamente.
Altre ricerche possono essere eseguite sulla base di un sospetto clinico di tubercolosi, polmonite atipica o virale.
          Colturale espettorato
Il protocollo standard prevede l'esecuzione di un esame microscopico per valutare l'idoneità del campione per indagini microbiologiche secondo Bartlett (presenza e numerosità di cellule epiteliali del cavo orale o "cellule di sfaldamento" e/o di globuli bianchi) e la presenza di flora microbica presumibilmente patogena.
Si procede all'esame colturale e alla determinazione della carica semiquantitativa di batteri.
Materiali necessari
Contenitore sterile a bocca larga, con tappo a vite
Procedure di prelievo

• Rimuovere sempre eventuali protesi dentarie
• risciacquare il cavo orale prima della raccolta del campione
• espettorare in un contenitore a bocca larga sterile e con tappo a vite (almeno 1 ml)
• evitare l'introduzione di materiale salivare o di secrezioni nasali nel contenitore per la raccolta, in caso contrario ripetere la procedura fin dall'inizio
• non raccogliere in modo cumulativo i campioni respiratori.

Una migliore raccolta dell'espettorato (specie a fronte di una scarsa espettorazione spontanea) si può ottenere con espettorato indotto, ottenuto dopo aver sottoposto il malato a manovre di fisioterapia e/o dopo inalazione, con l'ausilio di un nebulizzatore ultrasonico, di 20/30 ml di soluzione di NaCl allo 0,9%.

 

Conservazione e invio
Inviare tempestivamente il materiale al Laboratorio di Microbiologia, non oltre un’ora dalla raccolta, conservando a temperatura ambiente il campione. Il ritardo nella consegna può comportare "falsi negativi" (per perdita di vitalità dei patogeni) o "falsi positivi" (per sovracrescita di flora contaminante).
Conservare a temperatura di 2-8°C per un tempo massimo di 2 ore.
Colturale broncolavaggio/broncoaspirato
La modalità di prelievo consente la raccolta di materiale a bassa contaminazione salivare, pur richiedendo la messa in atto di procedure invasive.
Materiali necessari
Contenitore sterile dedicato.
Procedure di prelievo
La raccolta di secrezioni respiratorie attraverso “ prelievo protetto” costituisce manovra di competenza del medico specialista.
Conservazione e invio
Inviare tempestivamente il materiale al Laboratorio di Microbiologia, conservandolo a temperatura di 2 -8°C per un tempo massimo di due ore.

RICERCA MICOBATTERI
La finalità delle indagini è di ricercare in modo rapido e accurato, gli agenti responsabili d’infezioni sostenute da micobatteri, mediante:

• esame microscopico per ricerca di bacilli acido-alcol resistenti
• ricerca del genoma del M.tuberculosis c. con tecniche di amplificazione del DNA
• esame colturale, identificazione di specie ed esecuzione di test di sensibilità.

L'esame colturale rappresenta il gold standard, ma fornisce risultati in tempi molto lunghi per la lenta velocità di crescita dei micobatteri.

Conservazione e invio
Inviare tempestivamente il materiale al Laboratorio di Microbiologia; in caso d’invio ritardato, conservarlo a temperatura di 2 -8°C per un tempo massimo di 24 ore.
Tempi di risposta
Saranno disponibili on line l’esame microscopico e il test di biologia molecolare in 6-24 ore; l’esame colturale positivo mediamente in 15-30 giorni, mentre, se negativo, in 42 giorni.

CAMPIONI GENITO-URINARI
Essudato vaginale
L’esame dell’essudato vaginale serve per la diagnosi di vaginosi -vaginite e comprende:

• pH vaginale (al momento del prelievo)
• esame batterioscopico, previa colorazione di Gram, per valutare la cellularità, la presenza di flora lattobacilare e l’eventuale presenza di leucociti e di clue-cells
• diagnosi di vaginosi batterica secondo Nugent
• ricerca di Tichomonas vaginalis
• esame colturale secondo il seguente protocollo
• nelle donne in età fertile sono ricercati solo i miceti
• nelle donne in menopausa sono ricercati miceti ed Enterobatteri
• nelle donne in gravidanza sono ricercati miceti e S. agalactiae
• nella poliabortività può essere ricercata la L. monocitogenes
• nel tampone vulvare delle bambine prepuberi, oltre ai miceti, sono ricercati H.influenzae, S.pyogenes, S.aureus.

Materiali necessari

• Speculum bivalve sterile
• tampone con terreno di trasporto Amies (TransWab).

Precauzioni per il prelievo

• Non aver rapporti sessuali nelle 24 ore precedenti
• non essere in periodo mestruale
•  non eseguire irrigazioni vaginali nelle 24 ore precedenti l'esame.

          Procedure di prelievo

• eseguire il prelievo dal fornice posteriore mediante tamponi sterili, previa introduzione dello speculum.

Conservazione e invio
I campioni vanno inviati subito o possono essere conservati in terreno di trasporto a temperatura di 2- 8°C per 12-24 h.
Solo il tampone per la ricerca a fresco del Trichomonas vaginalis deve essere analizzato nel più breve tempo possibile.
Essudato balano-prepuziale
Materiali necessari
Tampone con terreno di trasporto Amies (TransWab).
Procedure di prelievo
Raccogliere con il tampone l’essudato presente nella zona del solco balano-prepuziale.

Conservazione e invio
I campioni vanno inviati subito o possono essere conservati in terreno di trasporto a temperatura di 2- 8°C per 12-24 ore.
Sperma
L'esame è indicato per la diagnosi d’infezione genitale e per l’accertamento di cause infettive d’infertilità, mentre per le prostatiti è preferibile il test di Stamey.
Materiali necessari

Contenitore sterile a bocca larga.

Precauzioni per il prelievo

• Astenersi dai rapporti sessuali nei tre giorni precedenti l'esame
• assicurare, con accurato lavaggio, la pulizia dei genitali esterni e delle mani

           Procedure di prelievo

• raccogliere il liquido seminale per masturbazione nel contenitore sterile, dopo aver urinato.

Conservazione e invio
Il materiale deve essere conservato a temperatura ambiente e inviato al laboratorio entro un’ora.
Secreto uretrale
L’esame del secreto uretrale ha la finalità di ricercare l’agente eziologico di uretrite e possono essere eseguiti:

• esame batterioscopico previa colorazione di Gram
• esame colturale per N.gonorrhoeae e altri eventuali patogeni da valutare per la loro significatività
• ricerca per Mycoplasma homininis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum e Ureaplasma parvum
• ricerca per Chlamydia trachomatis
• ricerca per Tichomonas vaginalis.

Materiali necessari
Tamponi Floq Swabs con tappo arancione.
Precauzioni per il prelievo

• Astenersi dai rapporti sessuali nelle 24 ore precedenti il prelievo
• non urinare nelle ore precedenti il prelievo (3 ore)

           Procedure di prelievo

• Detergere con soluzione fisiologica sterile il glande ed il meato uretrale esterno prima del prelievo
• introdurre il tampone per circa 2 cm all’interno del canale uretrale ruotandolo per circa 10 secondi.
• N.B.In alternativa è possibile eseguire la ricerca su urine primo mitto.

Conservazione e invio
I campioni vanno inviati subito o possono essere conservati in terreno di trasporto a temperatura di 2- 8°C per 12-24 ore.
Essudato cervicale
Le ricerche a livello cervicale per la diagnosi d’infezione sono indirizzate alla Neisseria gonorrhoeae, ai Micoplasmi urogenitali, all’Herpes simplex e alla Chlamydia trachomatis.
Materiali necessari

• Speculum bivalve sterile
• tampone con terreno di trasporto Amies (TransWab) per l’esame colturale
• tampone Floq Swabs (tappo rosso) per gli esami in biologia molecolare

 (C. trachomatis, N. gonorrhoeae, micoplasmi urogenitali, T. vaginalis, HSV).
Precauzioni per il prelievo

• Non avere rapporti sessuali nelle 24 ore precedenti
• non essere in periodo mestruale
• non eseguire irrigazioni vaginali nelle 24 ore precedenti il prelievo.

Procedure di prelievo

• Il prelievo deve essere eseguito a livello cervicale, previa introduzione dello speculum, nel seguente modo:
• rimuovere l'eccesso di muco
• inserire il tampone nell'endocervice per 1 cm e ruotare più volte.

N.B.
In caso di ulcere /vescicole a livello genitale sia nell’uomo sia nella donna è possibile la ricerca (dalla lesione) con test di biologia molecolare di HSV e Treponema pallidum.
Conservazione e invio
Se non è possibile l'invio immediato in laboratorio, i tamponi possono essere conservati a 2-8 °C per 24 ore, tranne che per l’esame colturale.
RICERCA HPV
L’infezione da HPV è molto frequente nella popolazione: si stima che oltre il 75% delle donne sessualmente attive s’infetti nel corso della vita, con un picco di prevalenza intorno ai 25 anni di età. La storia naturale dell’infezione è fortemente condizionata dall’equilibrio che s’instaura fra ospite e agente infettante. Esistono, infatti, tre possibilità di evoluzione dell’infezione da HPV: regressione, persistenza e progressione. La maggior parte (70-90%) delle infezioni da papilloma virus è transitoria perché il virus è eliminato dal sistema immunitario prima di sviluppare un effetto patogeno. La persistenza dell’infezione virale è, invece, la condizione necessaria per l’evoluzione verso il carcinoma della cervice uterina.
Procedure di prelievo
Nell’uomo si esegue tampone uretrale, nella donna tampone endocervicale, utilizzando, in entrambi i casi, tamponi dedicati per i test di biologia molecolare (tamponi Floq Swabs con tappo rosso o tappo arancione); la ricerca è possibile anche da lesioni in altri siti.
          Conservazione e invio
I tamponi possono essere conservati a 2°-8° C per 12-24 ore, in caso d’invio ritardato.

COLTURALE CAMPIONI BIOLOGICI VARI
Tampone da ferita superficiale su lesioni aperte (cutanee, piaghe, ulcere)
L'interpretazione dei risultati delle indagini microbiologiche effettuate da lesione è non sempre agevole, per la difficoltà di discriminare tra microbi colonizzanti o contaminanti e agenti responsabili del processo flogistico in atto; il protocollo standard prevede l'esame colturale con valutazione semiquantitativa della carica.
Materiali necessari
Tampone con terreno di trasporto Amies (TransWab).
Procedure di prelievo

• Rimuovere il tessuto necrotico/devitalizzato
• disinfettare la cute circostante la lesione
• lavare abbondantemente con fisiologica sterile
• raccogliere il materiale con movimento a zig-zag ruotando contemporaneamente il tampone e spingendolo sul fondo della lesione
• in caso di scarso materiale, dopo accurata decontaminazione dei margini della ferita, allargare gli stessi e far penetrare la punta di un tampone sottile nella parte profonda della ferita
• riporre il tampone nel contenitore contenente l'apposito terreno di trasporto.

Conservazione e invio
I campioni vanno inviati subito o possono essere conservati in terreno di trasporto a temperatura di 2- 8°C per 12-24 h.
Tampone da ferita chirurgica
I campioni di pus da raccolta chiusa (prelevati con siringa e inoculati sterilmente in flaconi Versatrek) sono da preferire ai tamponi, tenuto conto che la flora superficiale non rappresenta necessariamente la flora profonda all’interno di una ferita.
Pertanto è fondamentale la raccolta del campione durante la revisione chirurgica.
Il prelievo col tampone, inoltre, non consente la ricerca di anaerobi (tale ricerca è       possibile solo su materiale raccolto con siringa).
Materiali necessari
Tampone con terreno di trasporto Amies (TransWab).
Conservazione e invio
I campioni vanno inviati subito o possono essere conservati in terreno di trasporto a temperatura di 2- 8°C per 12-24 h.
Tampone auricolare
Le indagini microbiologiche consentono l'accertamento eziologico di otite esterna e otite media suppurativa. Il protocollo standard prevede la ricerca di batteri e miceti (inclusi i miceti filamentosi, quali Aspergillus spp).
La ricerca di Streptococcus agalactiae (Streptococco beta emolitico di gruppo B) è riservata ai neonati al momento della nascita, per escluderne la colonizzazione.
Materiali necessari
Tampone con terreno di trasporto Amies (TransWab).
Procedure di prelievo
Il prelievo, di competenza del medico specialista, salvo i casi di abbondante fuoriuscita di pus, prevede l’impiego di un otoscopio che , proteggendo il tampone      durante l’inserimento, consente la raccolta del materiale che fuoriesce dal timpano riducendo la contaminazione.
Conservazione e invio
I campioni vanno inviati subito o possono essere conservati in terreno di trasporto a temperatura di 2- 8°C per 12-24 h.
Tampone oculare
Le indagini microbiologiche consentono l'accertamento eziologico di congiuntivite e cheratite. Gli agenti più spesso responsabili sono cocchi Gram positivi (Stafiloccoccus aureus e Streptococcus pneumoniae), cocchi Gram negativi (Moraxella spp e Neisseria spp) e bacilli Gram negativi (Hemophilus spp, P. aeruginosa.)
In età neonatale può essere agente causale Chlamydia trachomatis, acquisita durante la fase espulsiva del parto.
Materiali necessari
Tampone sterile di piccolo calibro da inserire nel flacone con terreno di trasporto Amies (TransWab)
Tampone dedicato per biologia molecolare (Tamponi Floq Swabs con tappo arancione)
Procedure di prelievo

• Eseguire il prelievo prima che il paziente si lavi gli occhi
• inumidire il tampone in soluzione fisiologica o acqua distillata sterile
• allontanare la palpebra dal bulbo oculare
• raccogliere le secrezioni rollando col tampone sulla congiuntiva
• retrarre il tampone senza toccare le palpebre o le ciglia; in caso di errore ripetere la procedura fin dall'inizio.

Conservazione e invio
I campioni vanno inviati subito o possono essere conservati in terreno di trasporto a temperatura di 2- 8°C per 12-24 h.
punta catetere vescicale
La coltura della punta del catetere vescicale è utile per differenziare l’infezione dalla colonizzazione, ma è indispensabile richiedere contestualmente la coltura delle urine.

Materiale necessario

Contenitore sterile con tappo a vite
Procedure di prelievo

• Rimuovere il catetere, evitando la contaminazione con superfici non sterili
• tagliare la punta con forbici sterili
• riporre la punta nel contenitore sterile.

Conservazione e invio
Inviare il materiale in laboratorio entro le ore 14.00;in caso di invio ritardato
conservare  in frigorifero fino a 48 ore.
Punta catetere vascolare
L’uso di cateteri vascolari può portare a infezioni localizzate al sito d’inserzione e a infezioni sistemiche con batteriemia.
N. B. Per la diagnosi d’infezioni sistemiche a partenza dal catetere vascolare è opportuno, prima della rimozione del catetere stesso, eseguire due emocolture prelevate contemporaneamente da vena periferica e da catetere.

Materiale necessario

Provetta sterile con tappo a vite
Procedure di prelievo

• Disinfettare la cute intorno al catetere con antisettico per 1 minuto
• rimuovere il catetere, evitando la contaminazione per contatto con superfici non sterili
• tagliare la punta con forbici sterili per una lunghezza massima di 5 cm
• riporre la punta nella provetta sterile e umidificare con alcune gocce di soluzione fisiologica sterile.

Conservazione e invio
È possibile conservare il materiale in frigorifero fino a 48 ore.

 

COLTURE DI SORVEGLIANZA
Ricerca miceti
Le colture di sorveglianza per Candida e Aspergillus possono essere utiliper impostare terapie o profilassi antifungine in pazienti oncoematologici.
Tampone rettale di sorveglianza per KPC
Quando nel Reparto si verifica un caso d’infezione da K.pneumoniae resistente ai carbapenemi (KPC), bisogna attivare un programma di sorveglianza attiva per valutare l’eventuale colonizzazione intestinale da questo batterio multiresistente nei pazienti ricoverati.

• Se il paziente infetto da KPC è autosufficiente, devono essere sottoposti a sorveglianza solo i pazienti degenti nella stessa stanza del caso.
• Se il paziente è allettato, devono essere sottoposti a sorveglianza, oltre i compagni di stanza, tutti gli allettati del Reparto perché l’infezione può essere veicolata dal personale di assistenza Su ciascun contatto si dovrà eseguire un tampone rettale ogni settimana e sui pazienti della terapia intensiva all’atto del ricovero.

In caso di positività per K.pneumoniae resistente ai carbapenemi, vanno adottate in modo rigoroso le misure d’isolamento da contatto e /o da droplets.
La sorveglianza va proseguita su tutti i pazienti identificati come contatti e finchè non vi sia sufficiente evidenza che nel Reparto la trasmissione sia stata interrotta secondo i seguenti criteri:

• nessun caso di colonizzazione / infezione da tre settimane.
• adeguato isolamento di tutti i casi degenti nel Reparto durante le ultime tre settimane.

Materiale necessario

Tampone con terreno di trasporto  Amies (Transwab).
Procedure di prelievo
Inserire il tampone nel canale rettale per circa 2 cm, ruotandolo contro le pareti mucose fino a che non sia sporco di feci. .
Conservazione e invio       
I campioni vanno inviati subito o possono essere conservati in terreno di trasporto a temperatura di 2- 8°C per 12-24 ore.

ESAMI VARI
Antigene galattomannano
Il saggio immunoenzimatico per la ricerca del galattomannano (test GM) ha un’accertata attendibilità nei pazienti con malattia ematologica, per porre la diagnosi di aspergillosi.
Il test può essere eseguito sul broncoaspirato e/o su prelievi sierologici seriati.
Antigene mannano
Tra gli antigeni della Candida, il mannano è uno dei principali marcatori della candidosi invasiva.Pertanto, la sua ricerca rientra nella logica di un sistema di sorveglianza dei pazienti oncoematologici da utilizzare giornalmente, insieme con altri marcatori biochimici, in caso di sospetto clinico.
Multiplex P.C.R. virus respiratori
Essendo la sintomatologia da virus respiratori poco specifica e clinicamente non sempre differenziabile e la gravità non correlabile a uno specifico agente eziologico, è possibile eseguire una multiplex-P.C.R. che identifica i più frequenti virus causa d’infezioni respiratorie. I risultati sono utili per la sorveglianza epidemiologico-molecolare dei virus respiratori, per individuare emergenze sanitarie e per porre in essere strategie preventive e terapeutiche.
Di seguito sono elencati i virus identificati con il test:
Metapneumovirus, Adenovirus, Corovavirus NL63, V. Parainfluenzale1-2-3-4 Coronavirus, Rinovirus A/B/C, V. Respiratorio Sinciziale A - B, V. Influenzale A, V. Influenzale B, Enterovirus, Bocavirus.
Materiale necessario
Tampone dedicato di piccolo calibro. (tamponi Floq Swabs con tappo arancione).
Procedure di prelievo
Inserire lo stesso tampone nel naso-faringe, ruotandolo per qualche secondo in una narice e poi nell’altra.
N.B. È possibile utilizzare come materiale di partenza il broncolavaggio.
Conservazione e invio
I campioni possono essere conservati a 2-8°C per 12-24 ore,in caso di invio ritardato.
Multiplex P.C.R. Influenza A/B
In periodo endemico possono essere ricercati solo i virus causa dell’Influenza stagionale .
Osservare le stesse modalità di prelievo, conservazione e invio del multiplex virus.
Multiplex P.C.R. batteri atipici respiratori
I microrganismi causa di polmonite atipica e di pertosse non sono difficilmente identificabili con test culturale e ili test sierologico si positivizza tardivamente. Di qui l’utilità di un test in biologia molecolare che identifica da tampone naso-faringeo o da broncolavaggio i seguenti microrganismi: C. pneumoniae, M. pneumoniae, L. pneumophila, B. pertussis, B. parapertussis.
Osservare le stesse modalità di prelievo, conservazione e invio della multiplex virus.
Ricerca GBS in REAL TIME- PCR
L’infezione batterica da S. agalactiae è associata a malattie gravi (sepsi, polmonite, meningite) nei neonati nati da donne colonizzate.
La trasmissione può avvenire prima della nascita, ma soprattutto durante il parto.
Il test in Real time P.C.R., eseguibile in soli 75 minuti, si propone come alternativa al test colturale tradizionale, per il quale sono necessari 3-4 giorni.
Per le madri  di cui non è nota la colonizzazione il test può essere eseguito o sulla donna durante il travaglio o sul neonato alla nascita.
Procedure di prelievo

• Nella donna la ricerca si esegue da tampone vaginale o vagino-rettale utilizzando tamponi Floq Swabs con tappo rosso
• nel neonato si esegue da tampone auricolare al momento della nascita o da tampone faringeo nelle ore immediatamente successive, utilizzando tamponi Floq Swabs con tappo arancione.

Conservazione e invio
I tamponi possono essere inviati in laboratorio entro le ore 14.00; se eseguiti dopo, vanno conservati a 2°-8° C per 12-24 ore.
Ricerca diretta  RSV
La ricerca di antigeni virali su aspirato naso-faringeo consente l’accertamento rapido d’infezioni virali causate da virus respiratorio sinciziale (RSV), responsabile di bronchioliti nei neonati e nei bambini nel primo anno di vita.
Materiale necessario

• Tubicino per aspirazione naso-faringeo
• contenitore sterile.

Procedure di prelievo

• Inserire il tubicino nel naso –faringe
• immettere 2-3 ml di soluzione fisiologica
• aspirare e trasferire il campione nel contenitore sterile.

N.B. E’ possibile eseguire la stessa ricerca con tampone naso - faringeo, utilizzando tamponi Floq Swabs con tappo arancione.

 

Attività endotossina
L’endotossina, componente della parete cellulare dei batteri Gram negativi, è uno dei principali fattori nella patogenesi dello shock settico e nell’insufficienza d'or­gano multipla (MOF). Il test è specifico per l’ LPS dei batteri Gram negativi e non presenta reazioni crociate con i costituenti della parete cellulare di batteri Gram positivi e di altri microrganismi.
Materiale necessario
Provetta per emocromo
Conservazione e invio
Inviare immediatamente al Laboratorio di Microbiologia.
N. B. Non possibile la conservazione in frigo.
Ricerca MRSA in REAL TIME - PCR
Lo Staphilococcus aureus è un microrganismo che nel tempo ha acquisito sempre nuovi meccanismi di resistenza come la resistenza alla meticillina ed è causa d’infezioni nosocomiali. I programmi di controllo delle stesse infezioni vanno a valutare la colonizzazione nasale dei pazienti a rischio d’infezione , in particolare, al momento dell’ingresso in ospedale. Questo test, in soli 70 minuti, valuta la presenza dello S.aureus e del gene mec A, responsabile della resistenza alla meticillina.
Materiale necessario
Tampone dedicato di piccolo calibro (tamponi Floq Swabs con tappo arancione).
Procedure di prelievo
Inserire il tampone nel naso faringe, ruotandolo per qualche secondo in una narice e poi nell’altra. 
Conservazione e invio
In caso d’invio ritardato, i campioni possono essere conservati a 2-8°C per 12-24 ore.
T.SPOT TB (tecnica ELISPOT)
Gli Interferon-Gamma Release Assays (IGRAs) sono test diagnostici in vitro utilizzabili per la diagnosi d’infezione tubercolare latente (LTBI) e indicano la presenza di una risposta  immunitaria cellulo-mediata nei confronti del Mycobacterium tuberculosis c.
Non sono in grado di distinguere tra infezione latente (LTBI) e malattia attiva e non devono essere utilizzati per la diagnosi di TB attiva, che rimane una diagnosi microbiologica: un test IGRA positivo non indica necessariamente la presenza di una TB attiva, cosi come un test negativo non la esclude.
Tale test è indicato nelle seguenti condizioni cliniche:

• positivi al test di Mantoux, nel caso di precedente vaccinazione con BCG da meno di 10 anni
• soggetti pediatrici sotto i 10 anni
• pazienti con immunodeficienza
• operatori sanitari ad alto rischio di progressione a TB attiva, perché a stretto contatto con pazienti bacilliferi o con materiali biologici ad alto rischio.

N.B.Nei contatti recenti di bambini di età < 5 anni o immunodepresssi un test IGRA negativo va ricontrollato all’8a-10a settimana
Materiale necessario
Provette con eparina da 5 ml
Procedure di prelievo
Le provette devono essere riempite completamente per una corretta diluizione tra sangue e anticoagulante e invertite 8-10 volte immediatamente dopo il prelievo.
Conservazione e invio
I campioni devono essere inviati, subito dopo il prelievo, in laboratorio entro le ore 10.00 del martedì.
Dosaggio antibiotici
Per conseguire un’efficacia terapeutica ottimale e ridurre al minimo la tossicità, è possibile determinare i livelli sierici dei seguenti antibiotici su specifica richiesta e/o consulenza infettivologica.
Tobramicina, gentamicina amikacina,
L’intervallo terapeutico va misurato sia a valle sia 1/2 ora dopo fine infusione. Vancomicina /Teicoplanina
L’intervallo terapeutico va misurato con prelievo a valle prima della successiva somministrazione.
Bibliografia

 

• E.Tortoli, C. Piersimoni, C. Scarpato, D.Cirillo,E.Frizzera MICOBATTERIOLOGIA CLINICA II edizione CEA SELECTA MEDICA
• Goglio A. Prelievo, conservazione ed invio dei campioni per indagini microbiologiche A.O.Ospedali Riuniti Bergamo U.O. Microbiologi e Virolpgia
• Manuale prelievi e  raccolta campioni Servizio  Sanitario Regionale Emilia - Romagna
• Siti web: www.amcli.it/documenti/percorsi

                        www.evaluations-standards.org.uk

            

(http://www.hpa.-standardmethods.org.uk/wg_bacteriology.asp).